了解生化分析儀基本參數(shù)的原理,有利于儀器、試劑的正確使用,有助于正確分析和處理測定數(shù)據(jù)。但是,配套系統(tǒng)的原裝分析參數(shù)不宜更改;采用非儀器配套的試劑及校準品體系時,參數(shù)修改要慎重,對于不同儀器、不同類型的反應(yīng)分析程序,所顯示的人機對話分析參數(shù)信息有所不同。
一、反應(yīng)監(jiān)測時間
對于終點法來說,讀取反應(yīng)達到平衡時的吸光度計算樣品中待測物的濃度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說,要注意觀察反應(yīng)進程曲線,從而確定反應(yīng)的預(yù)孵育期,延遲時間、連續(xù)監(jiān)測的時段。對于一級或偽一級反應(yīng)來說,連續(xù)監(jiān)測的時間是一級反應(yīng)的動態(tài)期的吸光度;對于基于零級反應(yīng)的酶催化活性濃度速率法測定,連續(xù)監(jiān)測的是零級線性反應(yīng)期的吸光度。對于連續(xù)監(jiān)測法來說,動態(tài)反應(yīng)期的時間越長,越適用于臨床應(yīng)用,對于以酶為工具的代謝物酶促動力測定法,要增加動態(tài)反應(yīng)期,即延長反應(yīng)達到平衡的時間,可在反應(yīng)體系中加入競爭性抑制劑,這樣還可以提高測定的線性范圍,對于酶催化活性濃度連續(xù)監(jiān)測法來說,一定要注意線性反應(yīng)時間,有的酶,例如,以硫代丁酰膽堿為底物的血清假性膽堿酯酶速率測定法,線性反應(yīng)時間只有90秒。對于連續(xù)監(jiān)測法來說,在監(jiān)測期至少應(yīng)讀4個點(3個△A)。
多數(shù)全自動生化分析儀可以在整個測定反應(yīng)周期連續(xù)監(jiān)測(如HITACHI7170常規(guī)測定周期10分鐘、監(jiān)測34點,OLYMPUSAU600固定周期8分15秒、監(jiān)測27點),但反應(yīng)監(jiān)測時間是指該時間內(nèi)的測定讀數(shù)要用于結(jié)果計算。它的設(shè)置與加樣點、加試劑點(包括R1、R2……)、監(jiān)測時間(讀數(shù)點)、讀數(shù)間隔時間及試劑樣品比例等有關(guān),要結(jié)合方法學(xué),兼顧權(quán)衡。
1.反應(yīng)時間(ReactionTime)指儀器的一個分析周期中,試劑和樣品混合末一點測定讀數(shù)時間。它對終點法尤其重要,是終點法的瓶頸。有的儀器多個反應(yīng)時間可選L如Hl—TACHI7170),須預(yù)先選定。多數(shù)儀器10分鐘左右,這對試劑提出了較高要求。不少終點法試劑(尤其手工法試劑)反應(yīng)時間常常也在lO分鐘上下,測定時間沒有余地,當(dāng)樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降時,均可致測定結(jié)果偏低。因此,終點法不宜采用標明反應(yīng)時間接近和長于儀器大反應(yīng)時間的試劑盒。否則,必須用接近測定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監(jiān)測。
2.監(jiān)測時間(讀數(shù)點)和讀數(shù)間隔時間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數(shù)間隔時間短,監(jiān)測時間也短。流動式生化儀讀數(shù)間隔時間一般較長。分立式生化儀一般監(jiān)測時間10分鐘左右,間隔10-30秒讀數(shù)一次。有的儀器在整個測定反應(yīng)周期全程讀數(shù),有的只讀取時間(點)的吸光度。
3.加試劑點采用雙試劑時,加R2點決定R1與樣品的反應(yīng)時間,也決定R2與R1及樣品的反應(yīng)時間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI7170有4個加試劑點,若采用雙試劑,各5分鐘,則加R2設(shè)在第3加試劑點。
4反應(yīng)監(jiān)測時間還要考慮延遲時間的長短、測定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價值和工作效率等因素。
二、延遲時間
延遲時間(DelayTime)指試劑與樣品混合后到監(jiān)測開始之間的時間。一般用于兩點法和速率法,某些情況下也用于終點法。終點法應(yīng)選擇反應(yīng)趨于平衡的時間(穩(wěn)定期或平衡期)作測定,測定點前即所謂的孵育期。速率法的線性反應(yīng)期之前即延遲期。正確選擇延遲時間的長短,有利于準確測定,減少試驗誤差。設(shè)置一般根據(jù)試劑盒的說明書,還應(yīng)考慮本室的儀器特點和工作程序。
1.儀器特點比如,半自動生化儀多為流動比色池,要考慮泵速、進樣管長短、反應(yīng)液黏稠度及混合情況,以及室溫、反應(yīng)液溫度同反應(yīng)要求溫度間的溫差等。全自動生化儀的測定讀數(shù)設(shè)置方式不同,直接以“秒”設(shè)置,或以測定點設(shè)置、測定點間隔時間不一樣,需要靈活掌握。
2.試劑及方法學(xué)
(1)試劑組成在酶活性的連續(xù)監(jiān)測法時,若試劑含工具酶數(shù)量多、偶聯(lián)反應(yīng)多,則激活反應(yīng)時間一般較長,延遲時間也較長,如肌酸激酶(NAC法)延遲時間常設(shè)置120-180秒;若試劑中底物經(jīng)待測酶催化,其產(chǎn)物可以直接測定的,則延遲時間較短,如-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)設(shè)定30-60秒。同一項目同一方法,但試劑配方不同,其反應(yīng)快慢等特征也可能不同,如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠(BCG)為即時反應(yīng),10秒鐘內(nèi)已完成,其后球蛋白等也將與BCG發(fā)生反應(yīng),所以孵育時間不能延長。但在同一測定時間,BcG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不J司的試劑,測定結(jié)果可能差異明顯。
(2)樣品異常成分干擾有的試驗項目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡,比如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶(LDH)。如果使用單試劑,正常血清樣品延遲時間60秒即可;但當(dāng)內(nèi)源性酮酸增多(如酮癥酸中毒)時,試劑內(nèi)LDH常常不能在60秒內(nèi)*將其清除,剩余酮酸會進入監(jiān)測期干擾測定,使測定結(jié)果偏高,所以延遲時間應(yīng)增至90~120秒。采用雙試劑,則可在加入R1后即進入預(yù)孵育期。
(3)方法學(xué)要求比如肌酐(Jaffe法)測定的特異性不強,一般認為反應(yīng)前20秒左右為乙酰乙酸等快反應(yīng)干擾物呈色,后約80~100秒為蛋白質(zhì)等慢反應(yīng)假肌酐呈色,20~60秒肌酐呈色反應(yīng)占主導(dǎo)地位。采用兩點法或速率法可減少干擾,但具體取多長的延遲時間,應(yīng)根據(jù)試劑和儀器讀數(shù)特點,以干擾試驗等方法來評價決定。
3.工作程序要在保證準確性的前提下,合理設(shè)置參數(shù),提高工作效率。突出的例子是半自動生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測法的延遲時間設(shè)定。由于只能單份樣品逐一測定,若延遲時問全部設(shè)置在儀器內(nèi),每個延遲時間加監(jiān)測時間至少1分鐘以上,守候時間較長。工作量大時,可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點,以及室溫情況,將延遲時問挪一部分到機外,套式操作,但要確保機內(nèi)延遲時間不要進入線性反應(yīng)期。
4.要兼顧延遲時間和監(jiān)測時間反應(yīng)時間是有限制的。在速率法和兩點法中,延長延遲時間必然縮短線性監(jiān)測期,減少測定的線性范圍,也易發(fā)生底物耗盡。
三、樣品量、試劑量與稀釋量
有關(guān)參數(shù)包括樣品量、試劑量、稀釋水量、小反應(yīng)體積和大比色杯容量等。如HITACHI7170反應(yīng)體積180~380µl,大體積570µl。BT224半自動生化儀流動比色池容積33µl,吸液量200~990µl,適體積500µl。
1.小反應(yīng)體積在儀器光度讀數(shù)要用于結(jié)果計算時,反應(yīng)液液面高度不低于光度計光徑的小體積。它保證儀器的正確讀數(shù)和計算,也是儀器測定精度和經(jīng)濟性的指針之一。在有的儀器中,它以反應(yīng)體積的下限表示,有的則專門標明小反應(yīng)體積。在單試劑測定中,樣品與試劑的總體積不得少于此參數(shù)。在雙試劑測定中,若R1與樣品的反應(yīng)讀數(shù)不納入結(jié)果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數(shù),如連續(xù)監(jiān)測法;否則應(yīng)考慮它對結(jié)果的影響,如終點法在加R2之前讀數(shù),并以此來扣除試劑或樣品空白時。
在半自動生化儀中,適吸人量相當(dāng)于少反應(yīng)體積。它與進液管道長度、流動比色池容積,吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關(guān),它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此,吸人體積不能任意降低,必要時,應(yīng)加大反應(yīng)液量和吸人量。
2.大比色杯容量這個參數(shù)含義明確。在有的儀器中,它以反應(yīng)體積的上限表示,有的則專門標明大比色杯容量。反應(yīng)液超過此體積,將致液體外溢,儀器測定系統(tǒng)被污損。
3.樣品試劑比例樣品與試劑的比例(SV:RV),也可表示為樣品體積分數(shù)——樣品體積與反應(yīng)液總體積的比值(SV/TV),是方法學(xué)基本參數(shù)。酶活力測定中,樣品在總體積中的比例應(yīng)在10%以下。一般來說,待測物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動范圍大的,樣品用量較大。如Trinder反應(yīng)測定血清葡萄糖、膽固醇等,樣品試劑比例多為1:1OO,測定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇,常增加為1:50;ALT和AST的樣品試劑比例多為1:1O至1:20。方法靈敏、吸光度高的實驗方法,樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法,樣品試劑比例常為1:200。肌酐Jaffe氏法監(jiān)測時間短、吸光度值較低,樣品試劑比例多為1:10。一般應(yīng)以試劑說明為準,不宜輕易改動。
(1)改動樣品試劑比例,影響一系列方法學(xué)參數(shù)。若比例增大,則線性范圍縮小,線性反應(yīng)時間縮短,樣品內(nèi)源性干擾、基質(zhì)效應(yīng)增加、旁路反應(yīng)會增強,方法特異性也下降。若比例減少,檢測信號偏低,信噪比(噪音/信號)增大,當(dāng)儀器精度不高時,會加大測量誤差。
(2)改動樣品試劑比例,對某些反應(yīng)有影響。如堿性磷酸酶(AI_P),有文獻報道:當(dāng)樣品試劑比例從1:25降至1:50時,酶活力測定值增加,再低于1:50時不再增加。這一效應(yīng)可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結(jié)果。體液樣品稀釋也可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響:④大多數(shù)蛋白質(zhì)在濃溶液中的分子構(gòu)象比稀溶液中穩(wěn)定,樣品稀釋可影響酶的穩(wěn)定性。(2)降低樣品中內(nèi)源性抑制劑或激動劑的濃度,如以蒸餾水稀釋血清,可能因降低血清中淀粉酶的激動劑氯離子的濃度,致測定淀粉酶結(jié)果偏低;隨血清稀釋倍數(shù)增加,肌酸激酶測定活力增加,可能與降低樣品中AMt,、胱氨酸等內(nèi)源性抑制劑有關(guān)。
(3)雙試劑時要兼顧R1、R2和樣品三者的比例,尤其不宜改動試劑間的比例。R2要考慮儀器規(guī)定的加液小體積,同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經(jīng)濟問題等。
4.稀釋(水)量在加樣或加試劑時,加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個。一是用于濃縮試劑的稀釋,或樣品、校準品的稀釋。二是在樣品加量小的時候用來沖洗樣品探針,減小攜帶誤差;但用量不宜太多,以免稀釋試劑影響反應(yīng)。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應(yīng)液總體積考慮。必要時,干粉試劑復(fù)溶也要考慮此因素。
四、試劑空白(Reagentblank)監(jiān)測參數(shù)
無樣品或以水代替樣品在反應(yīng)過程中觀察試劑空白值或其變化情況,主要用于監(jiān)測試劑質(zhì)量及儀器穩(wěn)定性,利用試劑空白對試劑本身或反應(yīng)漂移引起的誤差進行補償,用以校正△A或△A/min。它與測定波長、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關(guān),不能盲目套用,必要時宜實際測定。
1.試劑吸光度上限和下限定點監(jiān)測試劑的吸光度。它常用規(guī)定波長及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點因儀器和測定方法的不同而有差異。終點法常在PO點讀數(shù),連續(xù)監(jiān)測法常以反應(yīng)監(jiān)測起始點來判讀。儀器在試劑空白檢測及相關(guān)的校準測定時,若監(jiān)測到超過此參數(shù)的限值,則提示試劑失效或校準無效。反應(yīng)吸光度向上的試驗取上限值:如Trinder反應(yīng)以酚或2-羥-3,5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用,生成紅色素,試劑有一定的自發(fā)氧化,其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0.1-0.4。以結(jié)合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應(yīng)吸光度向下的試驗取下限值:如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea(紫外法)等試驗,一般要求試劑吸光度下限≥1.0。
2.試劑空白速率顧名思義,它是在反應(yīng)過程中對試劑空白的變化速率作連續(xù)監(jiān)測,其數(shù)值在樣品測定結(jié)果中自動扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應(yīng)中,試劑空白速率也是試劑在監(jiān)測過程中底物自發(fā)降解的結(jié)果。底物為還原型輔酶者,本身不穩(wěn)定而分解,多呈下降趨勢;以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物,在堿性環(huán)境中自發(fā)水解成被測物質(zhì),多呈上升趨勢。此參數(shù)主要用于連續(xù)監(jiān)測法。一般認為酶活性測定的試劑空白速率(△A/min)應(yīng)≤0.001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標有關(guān),有時也以濃度單位表示。要根據(jù)K值、儀器穩(wěn)定性、方法允許變異而定。例如,ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應(yīng)≤10%,其試劑空白速率應(yīng)≤4.0U/L。一些儀器的程序參數(shù)中沒有此參數(shù),但我們應(yīng)在試劑空白的測定資料中關(guān)注它,若資料波動大,須查找試劑或儀器原因。
3.試劑空白的日常監(jiān)測測定方法設(shè)置了試劑空白的項目,都要先行作試劑空白測定,在樣品測定計算中自動扣除。由于試劑空白不是在每一個樣品測定中實時測定并扣除,當(dāng)樣品測定中試劑的變化在未達到參數(shù)設(shè)置限值時不易發(fā)現(xiàn),試劑空白扣除會產(chǎn)生誤差。所以,應(yīng)根據(jù)試劑的穩(wěn)定性確定試劑空白及相關(guān)的校準的測定頻率。連續(xù)監(jiān)測法的試劑應(yīng)每天(尤其在換另瓶或另批號試劑時)常規(guī)測定此參數(shù)。對樣品的異常結(jié)果.也應(yīng)及時對其測定吸光度資料(包括與試劑空白有關(guān)的資料,例如PO點讀數(shù))觀察分析。
4.有的半自動生化儀沒有試劑吸光度上限和下限設(shè)定,但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值,應(yīng)人工加以判斷。酶活力測定結(jié)果呈負值,有時可能與試劑空白錯誤有關(guān)。
5.試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的指針。因此,一定的校準頻率和室內(nèi)質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們在實際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數(shù)據(jù)在規(guī)定限值內(nèi),但質(zhì)控物測定結(jié)果連續(xù)偏低,病人結(jié)果因每天標本少而難以判斷,后發(fā)現(xiàn)是試劑質(zhì)量下降。
五、波長的選擇及測定模式
波長(Wave1ength)的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學(xué)方法有單波長和雙波長之分,有的儀器可用三波長、甚至多波長,以及兩波長比率等。有的儀器可作導(dǎo)數(shù)光譜分析。單波長測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長測定可以通過副波長加以修正,減少甚至消除干擾因素,提高測定準確性。采用同光束雙波長,亦有利于排除光源強度變化對結(jié)果的影響。
1.測定波長選擇有三個主要條件:
(1)待測物質(zhì)在該波長下的光吸收大。
(2)其吸收峰宜較寬而鈍,而不是處于尖峰或陡肩,一般不選光譜中的末端吸收峰,換句話說,該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小。
(3)常見干擾物在該波長下的光吸收小。試劑盒說明一般已提供波長參數(shù)。實際波長選擇需要了解待測物質(zhì)和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度,即以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
采用透射免疫比濁法,免疫復(fù)合物大小約35~100mn之間,于波長290~410nm下有大吸收峰,常取340nm;如用膠乳增強免疫濁度法,理想的檢測波長可增至可見光區(qū)。
2.雙波長測定當(dāng)待測物質(zhì)與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現(xiàn)非特異光吸收,或因反應(yīng)液混濁出現(xiàn)光散射時,可以采用雙波長(或多波長)測定。雙波長測定的原則是根據(jù)干擾組分和待測物質(zhì)吸收光譜的峰形特征,選擇兩個波長和,使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數(shù)相等,而使待測物質(zhì)在兩波長處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度,以兩個吸光度值之差(△A)計算。雙波長選擇常見:血紅蛋白340nm和380nm波長吸光度相同,以NADH或NADPH作為測定底物或產(chǎn)物的試驗常采用340/380nm;有的也.采用340/405nm。ALP和GGT常使405/476nm,Trinder反應(yīng)多選取520/600nm或550/660nm.免疫比濁常選用340/700nm等。
連續(xù)監(jiān)測法中,要注意雙波長測定有兩種類型的機型:主波長全程監(jiān)測副波長單點監(jiān)測,和雙波長全程監(jiān)測。不僅因為后者的準確性優(yōu)于前者,而且因為酶活性測定的K值計算與波長及摩爾吸光系數(shù)有關(guān),更顯重要。
副波長單點監(jiān)測:試劑和樣品混合后,雙波長只測一點,此后只用主波長連續(xù)監(jiān)測;計算時,全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長摩爾吸光系數(shù)即可。機型如Monarch1000,TechniconRA1000等。
雙波長全程監(jiān)測:全程每~測定點均用雙波長同測,并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產(chǎn)物在λ副波長時也存在一定的吸光系數(shù),K值計算代入的摩爾吸光系數(shù)值應(yīng)采用ε主減去ε副。如NADH的ε為6.22×10,為1.33×10,ALP產(chǎn)物ε為18.5x×10,ε為0.2×10很??;GGT產(chǎn)物在副波長處無吸光系數(shù)。