牛奶中蛋白質(zhì)的測(cè)定原理及其注意事項(xiàng)
摘要:本文主要針對(duì)應(yīng)用凱氏定氮法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的原理及其具體的消化和蒸餾過程中分別應(yīng)注意的幾大問題加以介紹,以期對(duì)從事蛋白質(zhì)測(cè)定工作的檢測(cè)人員有一定的幫助。
關(guān)鍵詞:牛奶蛋白質(zhì) 測(cè)定原理 注意事項(xiàng)
蛋白質(zhì)對(duì)于人體具有構(gòu)成體內(nèi)原生質(zhì)和修補(bǔ)身體組織,并制造酶和激素等生命基礎(chǔ)物質(zhì),調(diào)節(jié)生理機(jī)能的作用。蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物對(duì)食品的色、香、味和產(chǎn)品質(zhì)量都有一定的影響。蛋白質(zhì)的高低將直接決定食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。牛奶作為人體*的蛋白質(zhì)供給源,屬于*蛋白質(zhì),其中的8種人體必需氨基酸種類齊全,比例適當(dāng)。其蛋白質(zhì)含量達(dá)牛乳的3.4%左右,乳蛋白的消化吸收率一般為97%-98%,高于植物蛋白,而且消化速度又比肉、魚、蛋等動(dòng)物性蛋白快。測(cè)定蛋白質(zhì)的方法很多,目前zui基本和zui常用的方法是先測(cè)定總氮量,再乘以不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù),即為食品中蛋白質(zhì)的含量。測(cè)定總氮量的方法目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)仍采用凱氏定氮法為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法有常量法、半微量法和微量法等。其測(cè)定原理相同,主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小,實(shí)
0 引 言
驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些。另外,還有雙縮脲法、紫外吸收光譜法、福林-酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)染色法等,也常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,由于方法簡(jiǎn)單快速,多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。近年來國(guó)外還推出了近紅外品質(zhì)測(cè)試儀對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析的方法。但凱氏定氮法正由于它的諸多優(yōu)點(diǎn)而仍然應(yīng)用普遍。
1.測(cè)定原理
將含有蛋白質(zhì)的待測(cè)樣品同濃硫酸一起加熱消化,使氮變成氨,同時(shí)形成氨鹽,在消化液中加入過量的堿,再加熱將氨蒸餾出來,并收集于硼酸溶液中,zui后用酸堿滴定法測(cè)定其總氮量。
1.1 消化
樣品中含氮有機(jī)物與濃硫酸和催化劑一起加熱消化.使蛋白質(zhì)分解,分解的胺基氨與過量的硫酸結(jié)合生成硫酸胺留在溶液中,其主要反應(yīng)式為:
RCH.NH2COOH+H2SO4 ->CO2+SO2+NH3+H2O
2NH3+H2SO4->(NH4)2SO4
另外,催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后,溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色,可用它來指示消化終點(diǎn)。此外,硫酸銅還可用做下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。 過氧化氫,為氧化劑,有助于有機(jī)物消化,同時(shí)可以消除消化過程中的氣泡現(xiàn)象。
1.2 蒸餾
消化終了后所有蛋白質(zhì)的氨態(tài)氮都轉(zhuǎn)化成銨鹽形式,硫酸銨在堿性條件下進(jìn)行蒸餾,將釋放出來的氨用硼酸溶液吸收,生成四硼酸氫銨.其反應(yīng)式:
?。∟H4)2SO4+2NaOH ->Na2SO4+2NH3+2H2O
NH3+4H3BO3 ->NH4HB4O7+5H2O
1.3 滴定
用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定產(chǎn)生的四硼酸氫銨,根據(jù)消耗鹽酸溶液的量計(jì)算樣品含氮量,然后換算成蛋白質(zhì)含量。
NH4HB4O7+HCL+5H2O ->NH4CL+4H3BO3
2.試劑與儀器
2.1 儀器及用具
凱氏燒瓶(500ml) 容量瓶(100ml)錐形瓶 酸式滴定管(25ml或50ml)
上海沛歐SKD-08S2消化爐 上海沛歐 SKD-100,200,600定氮儀(或定氮蒸餾裝置)
2.2試劑
試劑要求均為分析純,所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制
濃硫酸 凱氏定氮催化劑過氧化氫溶液(體積分?jǐn)?shù)為30%)
NaOH溶液:(C(NaOH)=400g/L稱取400gNaOH固體,用100ml除去CO2的蒸餾水溶解,待冷卻后移入試劑瓶?jī)?nèi))
硼酸溶液:(C(H3BO3)為40g/L.稱取20g固體硼酸,溶解于500ml熱蒸餾水中,搖勻備用)
甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑: (用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇,將溴甲酚綠與甲基紅分別以2g/L溶于95%乙醇溶液中,使用時(shí)按5:1的比例混合)
鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:(C(HCL)=0.1000mol/L)
3. 操作過程的注意事項(xiàng)
3.1 消化
3.1.1凱氏定氮法的誤差,主要因消化操作的條件而產(chǎn)生,因此要格外注意。
4。結(jié)束語
3.1.2量取的樣品倒入凱氏燒瓶時(shí),不要將樣品粘在瓶頸上,以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不*.消化過程中要逐漸升溫,當(dāng)?shù)蜏丶訙刂脸霈F(xiàn)帶有硫酸的白色氣體后,才可升溫使溶液沸騰,但應(yīng)避免劇烈沸騰。
3.1.3消化過程中,消化液體積不可蒸至少于原來的三分之二,更不可蒸干,若硫酸損失過多,應(yīng)酌量補(bǔ)加硫酸。若取樣量較大,如干待測(cè)樣超過5克,可按每克試樣5毫升的比例增加硫酸用量。
3.1.4當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí),可將凱氏燒瓶冷卻,加入30%雙氧水2-3毫升后再繼續(xù)加熱消化。但在消化后期不得加入,因此消化液中還原物質(zhì)(如:碳)含量減少,氧化劑易造成氨進(jìn)一步氧化為氮逸出,使測(cè)定結(jié)果偏低。
3.1.5消化液澄清后,必須繼續(xù)加熱沸騰三十分鐘,以提高氮的回收率,若催化劑中有硒存在,加熱時(shí)間過長(zhǎng)也可能使氮素?fù)p失。一般情況下,純牛奶需消化4.5小時(shí)即可。
3.2蒸餾
3.2.1.消化液加蒸餾水稀釋后,應(yīng)及時(shí)蒸餾,否則應(yīng)保存消化液,臨用時(shí)再加蒸餾水稀釋.反應(yīng)室加入堿液后,應(yīng)立即蓋塞并加水封,注意各接頭處的密封情況,防止漏氣。
3.2.2 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑必須于臨用前按比例混勻,其在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。
3.2.3.蒸餾時(shí),加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外,還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用.反應(yīng)式:
2NaOH+H2SO4 ->Na2SO4+2H2O
2NaOH+CuSO4 ->Na2SO4+Cu(OH)2
Cu(OH)2 ->CuO +Cu(OH)2
若加入的氫氧化鈉不夠,則溶液呈藍(lán)色,不生成褐色的氫氧化銅沉淀.所以,加入的氫氧化鈉必須過量,并且動(dòng)作還要迅速,以防止氨的流失。
3.2.4.蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水裝至三分之二體積并且保持酸性(在蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水中加入稀硫酸,使之呈酸性,內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴,水應(yīng)呈橙紅色,如變黃時(shí),應(yīng)該補(bǔ)加酸),以防止在堿性條件水中游離氨蒸出,使結(jié)果偏大。
3.2.5.因蒸餾時(shí)反應(yīng)至外層的氣壓大于反應(yīng)室內(nèi)的壓力,而反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力,故可將氨帶出。所以,蒸餾時(shí),蒸氣要發(fā)生均勻,充足,蒸餾中不得?;饠鄽猓駝t,會(huì)發(fā)生倒吸。停止蒸餾時(shí),由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低,可使液體倒吸入反應(yīng)室外層,所以,操作時(shí),應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否*,可用精密PH試紙測(cè)冷凝管口的冷凝液來測(cè)定,中性則說明已蒸餾*。
3.2.6 在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時(shí),必須將基準(zhǔn)無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量,否則也會(huì)影響蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
牛乳提供了人體必需的蛋白質(zhì),而提供準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)含量則是食品檢驗(yàn)工作人員的必需技術(shù),凱氏定氮法作為目前法定的國(guó)標(biāo)方法與我們的工作密不可分,本文主要通過綜述凱氏定氮法操作的注意事項(xiàng)而提供給關(guān)注此檢測(cè)方法的從業(yè)人員一定的幫助,與筆者和讀者會(huì)有一定提高。